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                          當前位置:首頁  >  技術文章  >  大鼠軟骨細胞的制備要注意的事項

                          大鼠軟骨細胞的制備要注意的事項

                          更新時間:2022-08-27  |  點擊率:1535
                            軟骨細胞是軟骨組織中的主要細胞成分。位于軟骨陷窩中。軟骨細胞的核小,呈圓形或橢圓形,有1至數個核仁,胞質略嗜堿性。細胞形狀依軟骨組織而異:在透明軟骨,靠近軟骨膜的細胞呈橢圓形,其長軸與軟骨表面平行,深部的細胞逐漸變為圓形或卵圓形,常常兩個或多個聚集成群,稱為同源細胞群;在彈性軟骨,細胞的形態基本上與透明軟骨的相似;在纖維軟骨,細胞略呈卵圓形,夾在膠原纖維束之間,單個存在、成對存在或排列成單行。大鼠軟骨細胞分離自卵巢組織;卵巢是雌性動物的生殖器官,卵巢的功能是產生卵以及類固醇激素。卵巢的位置與睪丸相同,僅左側發育(右側已退化),呈葡萄狀,均為處于不同發育時期的卵泡,卵泡呈黃色,卵巢表面密布血管。卵巢的大小與年齡和產卵期有關。
                            1)大鼠關節軟骨細胞的取材、培養及細胞一般生物活性測定
                            取4~5周齡,體重185~200g的SD大鼠,斷頸處死,置于5%CO2混和氣體環境中,37℃恒溫箱內單層培養,隔3d初次換液,8~10d達85%融合后進行傳代。以臺盼藍染色法計算細胞活性?;钚约毎@得率(個/g)=細胞總數/軟骨消化量。細胞存活率(%)=活性細胞總數/(活性細胞總數+死細胞總數)×100%。細胞貼壁率(%)=(接種細胞總數-漂浮細胞數)×100%。軟骨細胞群體倍增時間(doubblingtimeDT)的測定:DT=(t-t0)log2/(logn-logn0)。接種時培養時間t0,細胞計數為n0;收集時培養時間為t,細胞計數為n。
                            2)倒置相差顯微鏡下形態學觀察
                            取每代貼壁軟骨細胞于倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。倒置相差顯微鏡觀察:原代軟骨細胞9~12h部分貼壁,大部分在24h時完成貼壁,部分細胞開始伸展,細胞體積較小,呈多角形,均勻散在生長,48h內基本上鋪展成三角或多角形;7~10d達到90%融合形成單層細胞,細胞仍呈多角形或短梭形,細胞排列緊密,折光性強。傳代細胞貼壁時間為2~4h,第1~2代細胞生長旺盛,3~4d細胞即可融合,細胞呈多角形小部分細胞形態狹長。第3代細胞形態逐漸變狹長,折光性減弱。第5代以后,均呈長梭型老化。8、9代后細胞梭狀鋪平,鏡下長而大,折光差,部分細胞脫落,形態不規則。
                            3)軟骨細胞透射電鏡觀察胰酶消化各代次軟骨細胞,離心后先于離心管培養3d,送福建醫大電鏡室制片觀察。經離心管培養3d后,固定標本進行電鏡技術觀察,原代P0培養軟骨細胞為卵圓形或圓形,細胞核清晰,較多異染色質分布于核膜邊緣和核內。胞漿內有較多糖原顆粒和分泌囊泡,胞漿內含有豐富的內質網和高爾基體。細胞周圍和細胞間可見網絡樣結構及少量膠原纖維和蛋白聚糖,但是結構較稀疏,排列較亂,缺乏緊密的膠原網絡結構。傳代后P1軟骨細胞體積逐漸增大,胞漿內細胞器減少。細胞外膠原纖維增粗,量變少,蛋白聚糖進一步減少,末發現凋亡軟骨細胞。P2代軟骨細胞為三角形或卵圓形,細胞核及核仁清晰,少許異染色質沿核膜均勻分布,核內以常染色質為主。胞漿內有較多糖原顆粒和分泌囊泡,內質網和線粒體較豐富。
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